Autoantikroppar mot dubbelsträngat DNA (dsDNA) ger upphov till en homogen kärnfärgning vid indirekt immunofluorescens (IIF) på HEp-2-celler, d.v.s. vanliga ANA-analys. Strukturer i kärnan som är associerade med DNA, såsom nukleosomer och histoner, ger också ett homogent mönster så ytterligare test krävs för att fastslå att det är just dsDNA som autoantikropparna är riktade mot.
Homogen ANA kan orsakas av autoantikroppar mot dubbelsträngat DNA, nukleosomer, histoner, eller något annat. Bild: Hannes Lindahl
Ett test för dsDNA-ak som kan användas för konfirmering är IIF med parasiten Crithidia luciliae fixerat på objektsglasen. Antikroppar mot dsDNA ger då en karaktäristisk infärgning av en organell (kinetoplast) i den encelliga organismen. Det så kallade Crithidia luciliae immunofluorescens test (CLIFT) används ofta just som bekräftande test eftersom specificiteten är särskilt hög p.g.a. av att endast antikroppar med medel till hög affinitet ger positivt resultat vilka i många fall är just de som är kliniskt relevanta. Vid positivt resultat för anti-dsDNA men negativt resultat med CLIFT kan detta tolkas som tidig SLE, inaktiv SLE, eller ett falskt positivit resultat. Även ELISA, ALBIA, och lineblot används för detektion av dsDNA-ak.
Autoantikroppar mot dubbelsträngat DNA detekterat med indirekt immunofluorescens på den encelliga parasiten Crithidia luciliae. Vid positivt resultat ses distinkt fluorescens i kinetoplasten, en organell som befinner sig i närheten av flagellen (svansen) men fixerad mot ena sidan. Bild: Hannes Lindahl
Anti-dsDNA är ett fynd som har hög specificitet för SLE vilket innebär att de sällan ses vid andra sjukdomar eller hos friska. Följaktligen ingår dsDNA-ak i den senaste uppdateringen av klassifikationskriterierna för SLE. Prevalens hos friska blodgivare är 1-2% men då i allmänhet i låga nivåer.
Anti-dsDNA speglar även sjukdomsaktiviteten vid SLE och används ibland vid terapiuppföljning. Dessutom är dessa autoantikroppar kopplade till njurengagemang vid SLE, vilket gör att fyndet kan motivera ökad vaksamhet avseende njurfunktionen.
Anti-dsDNA har ett internationellt etablerat referensstandardpreparat och resultat svaras ofta ut som internationella enheter (IE) per volym. Detta gör att resultat från olika laboratorier kan jämföras.
Litteratur
Aringer M, et al. 2019 European League Against Rheumatism/American College of Rheumatology Classification Criteria for Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheumatol. 2019 Sep;71(9):1400-1412. doi: 10.1002/art.40930
Kärnantikroppar (ANA), d.v.s. autoantikroppar som binder in till komponenter i cellkärnan har varit centralt vid diagnostik av autoimmuna sjukdomar sedan 50-talet. Traditionellt påvisas ANA med celler odlade på objektsglas och bedöms visuellt i mikroskop. Med tiden har man lärt sig att olika specificiteter (målmolekyler i cellen som ger olika mönster i mikroskopet) är kopplade till olika sjukdomar. ANA analyseras i första hand vid misstänka om systemisk lupus erytematosus (SLE), Sjögrens syndrom, systemisk skleros, polymyosit, mixed connective tissue disease (MCTD), eller autoimmun hepatit.
För ANA används vanligen celler som kallas HEp-2 som är en cellinje framtagen från människa. HEp-2 har stor cellkärna och hög delningshastighet vilket ger goda chanser att se celler i olika delar av cellcykeln i samma synfält vid avläsning i mikroskop. Patientserum tillsätts och eventuella autoantikroppar får chans att binda in till antigen i cellerna. Efter tvätt tillsätts grönt fluorescerande detektionsantikroppar riktad mot alla antikroppar av IgG-typ som finns på objektsglaset. Vid positivt resultat analyseras provet igen med flera olika spädningar och den högsta spädningen (mest utspädda provet) som fortfarande ger positivt resultat anges som en titer i svaret från laboratoriet. Denna metod kallas indirekt immunofluorescens (IIF) och anses fortfarande vara guldstandard även om bra antigenspecifika metoder har utvecklats på senare tid.
Kliniska immunologilaboratorier ska ha flera metoder uppsatta för ANA för att kompensera för metodspecifika svagheter och dessutom ha möjlighet att bekräfta positiva fynd. ALBIA (t.ex. Luminex) är en bra metod för ANA-specificiteter såsom dubbelsträngat DNA och specifika proteiner i cellkärnan, för vilka termen extractable nuclear antigens (ENA) används. Alternativt kan ANA-specificiteter analyseras med utvalda antigen bundna till cellulosamembran, vilket kallas lineblot.
Huruvida fynd av autoantikroppar mot sjukdomskopplade antigen utanför cellkärnan rapporteras som positiv ANA varierar men en medelväg är att i dessa fall svara ut ANA som negativ men kommentera bifyndet att cytoplasmatisk reaktivitet ses och vilken sjukdom detta mönster i första hand skulle kunna vara förenligt med. Detta medför att termen ANA strikt sett är något föråldrad. Det har föreslagits att en mer korrekt term ska ersätta ANA, exempelvis anti-cellular antibodies som redan är etablerat på ett fåtal ställen i världen.
Dessa är de vanliga mönster som alla klassificeras som positiv ANA med angivet mönster och titer i svaret från laboratoriet: Homogen, Kornig, Nukleolär, Centromer, Kärnmembran, Nuclear dots, Proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
Homogen ANAKornig ANANukleolär ANACentromer-ANANuclear dots-ANA. Bilder: Hannes Lindahl
ANA ska enligt den överenskomna definitionen vara positiv hos knappt 5% av friska blodgivare. Detta innebär att alla laboratorier måste justera sitt protokoll för analys av ANA så att gränsen för positivitet uppfyller detta kriterium. Detta görs främst genom att välja en lämplig grundspädning med vilken inte för många (eller för få) friska blodgivare klassificeras positiva avseende ANA.
Hos äldre och sjukhusvårdade förväntas andelen vara högre. Detta innebär att det positiva prediktiva värdet av positiv ANA i en oselekterad grupp människor är lågt och pre-test probability måste vara tydligt förhöjd för att testet ska vara meningsfullt. Vissa ANA-mönster och ANA-specificiteter kan ha något högre specificitet dock. Men det ändrar inte faktumet att ANA inte är lämplig som ett screening-verktyg på stora delar av befolkningen.
Agmon-Levin N, et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 2014 Jan;73(1):17-23. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-203863
Sharp GC, et al. Mixed connective tissue disease–an apparently distinct rheumatic disease syndrome associated with a specific antibody to an extractable nuclear antigen (ENA). Am J Med. 1972 Feb;52(2):148-59. doi: 10.1016/0002-9343(72)90064-2
Bossuyt X, et al. Understanding and interpreting antinuclear antibody tests in systemic rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2020 Dec;16(12):715-726. doi: 10.1038/s41584-020-00522-w
