Kategorier
analyser komplementsystemet

Komplementsystemet

Komplementanalyser kan ge information om

  1. aktivering av komplementsystemet (egentligen förbrukning av komplementfaktorer), främst när detta sker i blodet, och
  2. brist på enskilda komplementfaktorer som antingen kan leda till sänkt eller ökad aktivering av komplementsystemet.

Generellt visar sig detta som oväntat låga nivåer av en eller flera komplementfaktorer i blodprovet. Förutom att mäta koncentrationen av enskilda komplementfaktorer görs i klinisk rutin även tester där delar av komplementsystemet aktiveras i provröret för att screena för brist avseende en eller flera av de faktorerna som behövs för att slutprodukten av komplementkaskaden, membrane attack complex (MAC), ska bildas.

Komplementaktivering sker normalt lokalt t.ex. i en led och påverkar då inte nivåerna av de analyserade komponenterna nämnvärt men när komplementaktivering sker i blodbanan, t.ex. av cirkulerande immunkomplex vid SLE, kan nivåerna av de analyserade komponenterna sjunka p.g.a. konsumtion.

Vissa komplementfaktorer såsom C3 och C4 är akutfasreaktanter och stiger vid inflammation. Detta innebär att utebliven stegring av dessa komplementfaktorer vid tecken på inflammation såsom högt CRP också kan tala för komplementkonsumtion.

Medfödd brist på komplementfaktorer är mycket ovanligt med undantag för brister specifikt i lektinvägen, vanligen brist på mannos-bindande lektin (MBL), som isolerat troligen bara ger en lätt ökad infektionskänslighet.

Patologisk aktivering av komplementsystemet pga komplementbrist ses vid vissa sällsynta sjukdomar, t.ex. hereditärt angioödem där orsaken är avsaknad eller nedsatt funktion av C1-inhibitor. Vid hereditärt angioödem ses ökad komplementaktivering (klassiska vägen) men den djupa slemhinnesvullnaden, angioödem, orsakas främst av överdriven aktivering av kallikrein-kinin-systemet, som också hämmas av C1-inhibitor. 

korta fakta om komplementsystemet som kan läggas på minnet

  • Gemensamt för alla 3 vägarna för komplementaktivering är aktivering (klyvning) av C3.
  • Klassiska vägen och lektinvägen aktiverar C3 via C2 och C4
  • Klassiska vägen triggas av immunkomplex (lösliga antikropp-antigen-komplex)
  • Klassiska: Immunkomplexen aktiverar C1q-komplexet som leder till aktivering av C4 och C2
  • Lektinvägen triggas av cirkulerande pattern recognition receptors (PRR) som binder till ytstrukturer på bakterier.
  • Klassiska vägen och lektinvägen är ganska lika. Immunkomplex aktiverar C1q-komplex som leder till aktivering av C4 och C2 respektive PRR och ligand binder till sig ett annat protein vilket leder till aktivering av C4 och C2. C2 och C4 går sedan ihop (bildar C3-konvertas) för att aktivera C3.
  • Alternativa vägen kringgår C2 och C4 för att aktivera C3 direkt
  • Alternativa vägen triggas av “accelerated C3 tick-over” som har beskrivits som ökad spontan hydrolys av C3 i närvaro av förändrade cellmembraner eller patogener.
  • C3 och C4 är akutfasreaktanter
  • C3 och C4 är de enda lösliga komplementproteinerna som kan binda till ytor
  • Terminala vägen inleds med att aktiverat C3 går ihop med aktiverade C4 och C2 och bildar tillsammans ett komplex som kan aktivera C5.
  • C5 initierar det cytolytiska MAC-komplexet som vidare byggs upp med C6, C7, C8, C9.
  • Det är främst komplementaktivering i cirkulationen som påverkar analysresultaten
  • Prover bör komma till laboratoriet inom några timmar (4-24 timmar anges, beroende på lab)

Lathund för komplementbrist

Här är en lathund för tolkning av komplementanalyser avseende möjlig komplementbrist (anpassat från Ling och Murali)

Klassiska vägenAlternativa vägenMisstänk brist avseende
<10%normalC1q, C1r, C1s, C2, C4, C1-inhibitor
normal<10%Faktor D, Faktor B, Properdin
<10%<10%C3, C5, C6, C7, C8, C9, Faktor H, Faktor I

Kort historik

Komplementsystemet upptäcktes och namngavs i slutet av 1800-talet. Man hade observerat en värmestabil substans i serum med bred antimikrobiell aktivitet (d.v.s. antikroppar) och dessutom en värmelabil substans som förstärkte denna effekt, som ett komplement helt enkelt.

Att testa komplementfunktion i ELISA-format

  1. en platta coatad med IgM för att aktivera den klassiska vägen
  2. en platta coatad med LPS för att aktivera den alternativa vägen
  3. en platta coatad med mannan för att aktivera lektinvägen. Här inkluderas även en lösning som stoppar aktiveringen av klassiska vägen som annars skulle ske pga immunkomplex som bildas mellan mannan och naturligt förekommande manna-antikroppar i patientprovet.

Detektionsantikroppen binder till MAC-komponenten C5b-9 som normalt inte finns i patientprovet men bildas vid komplett aktivering av komplementkaskaden via någon av de tre vägarna.

Plattan avläses som vanligt i en ELISA-läsare och absorbansen i brunnen med patientprovet delas på den genomsnittliga absorbansen för flera friska kontroller. Värdet multipliceras med 100 för att ge procent av förväntad aktivitet för respektive aktiveringsväg. 

Litteratur

Killick J, et al., Complement as a regulator of adaptive immunity. Semin Immunopathol. 2018 Jan;40(1):37-48. doi: 10.1007/s00281-017-0644-y

Ling M, Murali M. Analysis of the Complement System in the Clinical Immunology Laboratory. Clin Lab Med. 2019 Dec;39(4):579-590. doi: 10.1016/j.cll.2019.07.006

Seelen MA, et al., Functional analysis of the classical, alternative, and MBL pathways of the complement system: standardization and validation of a simple ELISA. J Immunol Methods. 2005 Jan;296(1-2):187-98. doi: 10.1016/j.jim.2004.11.016

Weinstein A, et al., A Review of Complement Activation in SLE. Curr Rheumatol Rep. 2021 Feb 10;23(3):16. doi: 10.1007/s11926-021-00984-1.

Kategorier
analyser reumatoid faktor

Reumatoid faktor

Reumatoid faktor (RF) är autoantikroppar som binder till den icke-variabla delen (Fc-delen) av antikroppar av IgG-typ. Jämfört med anti-citrullinerade protein-ak (ACPA, CCP-ak) har RF liknande sensitivitet för RA (cirka 70%) men betydligt lägre specificitet (cirka 85%). RF förekommer vid andra immunmedierade sjukdomar och gränsvärdet för positivt resultat har satts så att cirka 5% av friska blodgivare har positiv RF.

RF kan ha olika isotyper (klasser) och binder inte till fritt IgG utan bara IgG fäst vid något. Historiskt detekterades RF med olika agglutinationstester som avlästes visuellt (fårerytrocyter eller latexkulor täckta med IgG som klumpas ihop när RF finns i serumprovet). Det är främst RF av IgM-typ som detekteras i dessa tester eftersom IgM, som kan bilda stora pentamerer, har lättast att överbrygga avståndet mellan bundna IgG.

I och med utvecklandet av nefelometriska och turbidometriska metoder blev det möjligt att automatisera analysen men med dessa metoder är det fortfarande främst RF av IgM-typ som detekteras. Med ELISA och andra metoder som inkluderar detektionsantikroppar (anti-humant IgM, m.m.) har det blivit möjligt att analysera isotyp-specifik RF, alltså enbart av IgM-, IgG-, och IgA-typ.

Detektion av isotyp-specifik RF av IgM-typ har något bättre specificitet för RA jämfört med traditionell RF och ytterligare högre specificitet uppnås om flera (2 eller 3) olika isotyper av RF detekteras. RF av IgA-isotyp har kopplats till sämre prognos.

En referensstandard (W1066) har etablerats sedan länge vilket gör att RF oftast rapporteras som internationella enheter (IE) per volym prov. Dock är den kvantitativa överensstämmelsen mellan olika laboratorier och metoder erkänt dålig för RF. Nivån speglar dock inte sjukdomsaktivitet särskilt väl. RF analyseras inom svensk sjukvård med nefelometri eller FEIA (ImmunoCap) och den senare krävs för isotyp/klass-specifik RF.

Litteratur

Rönnelid J, Turesson C, Kastbom A. Autoantibodies in Rheumatoid Arthritis – Laboratory and Clinical Perspectives. Front Immunol. 2021 May 14;12:685312. doi: 10.3389/fimmu.2021.685312

Li R, et al. Validation of new classification criteria of rheumatoid arthritis in an international multicentre study. Clin Exp Rheumatol. 2020 Sep-Oct;38(5):841-847

Kategorier
analyser CCP-ak

Cykliska citrullinerade peptider-ak

Autoantikroppar mot citrullinerade proteiner/peptider (ACPA) detekteras nästan bara hos personer som har eller kommer att utveckla reumatoid artrit (RA), d.v.s. det är en mycket användbar och sjukdomsspecifik biomarkör.

Dessa antikroppar detekteras i allmänhet med kommersiella kit från olika företag som alla använder samma patenterade och hemliga sammansättning av cykliska citrullinerade peptider (CCP). De bygger på CCP version 2 (CCP2) som togs fram genom att miljontals peptider testades mot serumprover från RA-patienter. Ett urval av de peptider som hade de bästa diskriminativa egenskaperna valdes ut för att ingå i testet. Peptiderna görs cykliska för att det förbättrar antikropparnas bindning till de citrullinerade epitoperna.

Det finns även kit som bygger på andra antigen för att detektera ACPA, t.ex. CCP3, muterat och citrullinerat vimentin (MCV), citrullinerat filaggrin från råtta, och ett citrullinerat EBV-protein (VCP2). Med undantag för CCP3, fungerar tester med dessa antigen överlag sämre än det etablerade CCP2. I forskningsyfte används tester för att detektera IgA eller IgM mot ACPA men det är oklart ännu om denna information tillför något som påverkar patientens vård.

CCP-ak detekteras inom svensk sjukvård med ALBIA (Luminex), FEIA (ImmunoCap), eller kemiluminescens. Det finns inget etablerat internationellt standardpreparat som företagen använder för kalibrering av sina metoder vilket innebär att värden framtagna med olika företags kit inte kan jämföras.

CCP-ak har liknande sensitivitet som reumatoid faktor (RF) för RA-diagnos, cirka 70%. Denna blygsamma siffra är förenlig med att seronegativ RA är en väl etablerad undergrupp till RA. Specificiteten är dock betydligt högre, 98% för CCP-ak jämfört med 85% för RF. Av den anledningen är CCP-ak det rekommenderade testet inom primärvården vid misstanke om RA. Att använda RF i den situationen skulle ge för många falskt positiva resultat.

CCP-ak kan detekteras flera år före debut av kliniska symtom och RA-insjuknande. RA med CCP-ak (liksom RF) innebär sämre prognos men antikroppsnivåer kan likväl inte användas för att följa sjukdomsaktivitet hos en enskild patient.

Litteratur

Rönnelid J, Turesson C, Kastbom A. Autoantibodies in Rheumatoid Arthritis – Laboratory and Clinical Perspectives. Front Immunol. 2021 May 14;12:685312. doi: 10.3389/fimmu.2021

Li R, et al. Validation of new classification criteria of rheumatoid arthritis in an international multicentre study. Clin Exp Rheumatol. 2020 Sep-Oct;38(5):841-847

Kategorier
analyser dsDNA-ak

Dubbelsträngat DNA-ak

Autoantikroppar mot dubbelsträngat DNA (dsDNA) ger upphov till en homogen kärnfärgning vid indirekt immunofluorescens (IIF) på HEp-2-celler, d.v.s. vanliga ANA-analys. Strukturer i kärnan som är associerade med DNA, såsom nukleosomer och histoner, ger också ett homogent mönster så ytterligare test krävs för att fastslå att det är just dsDNA som autoantikropparna är riktade mot.

Homogen ANA kan orsakas av autoantikroppar mot dubbelsträngat DNA, nukleosomer, histoner, eller något annat. Bild: Hannes Lindahl

Ett test för dsDNA-ak som kan användas för konfirmering är IIF med parasiten Crithidia luciliae fixerat på objektsglasen. Antikroppar mot dsDNA ger då en karaktäristisk infärgning av en organell (kinetoplast) i den encelliga organismen. Det så kallade Crithidia luciliae immunofluorescens test (CLIFT) används ofta just som bekräftande test eftersom specificiteten är särskilt hög p.g.a. av att endast antikroppar med medel till hög affinitet ger positivt resultat vilka i många fall är just de som är kliniskt relevanta. Vid positivt resultat för anti-dsDNA men negativt resultat med CLIFT kan detta tolkas som tidig SLE, inaktiv SLE, eller ett falskt positivit resultat. Även ELISA, ALBIA, och lineblot används för detektion av dsDNA-ak.

Autoantikroppar mot dubbelsträngat DNA detekterat med indirekt immunofluorescens på den encelliga parasiten Crithidia luciliae. Vid positivt resultat ses distinkt fluorescens i kinetoplasten, en organell som befinner sig i närheten av flagellen (svansen) men fixerad mot ena sidan. Bild: Hannes Lindahl

Anti-dsDNA är ett fynd som har hög specificitet för SLE vilket innebär att de sällan ses vid andra sjukdomar eller hos friska. Följaktligen ingår dsDNA-ak i den senaste uppdateringen av klassifikationskriterierna för SLE. Prevalens hos friska blodgivare är 1-2% men då i allmänhet i låga nivåer.

Anti-dsDNA speglar även sjukdomsaktiviteten vid SLE och används därför vid terapiuppföljning. Dessutom är de kopplade till SLE med njurengagemang, vilket kan motivera ökad vaksamhet avseende njurfunktionen.

Anti-dsDNA har ett internationellt etablerat referensstandardpreparat och resultat svaras ofta ut som internationella enheter (IE) per volym. Detta gör att resultat från olika laboratorier kan jämföras.

Litteratur

Aringer M, et al. 2019 European League Against Rheumatism/American College of Rheumatology Classification Criteria for Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheumatol. 2019 Sep;71(9):1400-1412. doi: 10.1002/art.40930

Kategorier
analyser SSA-ak (Ro52, Ro60)

SSA-ak (Ro52, Ro60)

Autoantikroppar mot SSA (kallas också Ro) ingår i klassifikationskriterierna för Sjögrens syndrom (SS) och är associerade med sämre prognos.

Anti-SSA-52 kDa (anti-Ro52) och anti-SSA-60 kDa (anti-Ro60) beskrivs ibland tillsammans som anti-SSA men är egentligen två olika antikropps-specificiteter. Dessa två autoantikroppar förekommer ofta tillsammans men antigenen är del av olika proteiner. Samvariationen reflekterar sannolikt någon form av gemensam toleransförlust.

Om en kvinna har någon av dessa autoantikropparna under graviditeten är risken ökad att barnet kommer att födas med en blockering i hjärtats retledningssystem, AV-block III. Detta är en del av sjukdomsbilden som kallas neonatal lupus, en form av passivt överförd och övergående autoimmunitet hos fostret. Sjukdomsmekanismerna är inte klarlagda men möjligen är det så att dessa antikroppar inducerar inflammation karaktäriserad av ökad typ I interferon-signalering hos modern och/eller fostret som i sin tur har negativ effekt på anläggningen av retledningssystemet i fostrets hjärta. Aktiviteten av gruppen cytokiner som kallas typ I interferon mäts ofta indirekt genom att kvantifiera uttrycket av en panel gener som induceras av dem, s.k. type I interferon score, och det har föreslagits att detta skulle kunna användas som biomarkör för att identifiera foster med neonatal lupus (Hedlund M et al).

Anti-SSA 52 kDa/anti-Ro52

Antigenet Ro52 finns på proteinet TRIM21, som utövar olika dämpande funktioner på immunsystemet. I djurmodeller är anti-Ro52 sjukdomsdrivande och det finns stöd för att dessa autoantikroppar åtminstone är funktionellt aktiva hos människa men det är mer osäkert hur mycket skada de orsakar.

Anti-Ro52 är bland de vanligaste autoantikropparna som detekteras hos personer med reumatiska sjukdomar överlag och denna brist på specificitet gör att de har begränsat kliniskt värde i sig. Anti-Ro52 finns hos cirka:

  • 60% av personer med primär SS (oftast detekteras även anti-Ro60)
  • 40% av personer med sekundär SS.
  • 40-50% av personer med SLE. Det är intressant att anti-Ro52 och anti-Ro60 ofta är de första autoantikropparna som bildas vid SLE, åratal före diagnos och före mer SLE-specifika markörer såsom anti-dubbelsträngat DNA.
  • 20% av personer med systemisk skleros
  • 30% av personer med inflammatorisk myosit. Vid myosit av typen antisyntetassyndrom är det faktiskt den vanligaste autoantikroppen som detekteras (upp till 60% av fallen).

När anti-Ro52 detekteras vid etablerad SLE, systemisk skleros, eller myosit är det ovanligt att det är det enda antikroppsfyndet. För dessa sjukdomar kan anti-Ro52 ofta tolkas som en markör för sämre prognos, inte sällan kopplat till interstitiell lungsjukdom.

Anti-SSA 60 kDa/anti-Ro60

Antigenet Ro60 sitter på Y RNA binding protein (kodat av genen TROVE2) som binder till icke-kodande RNA, troligen för att rensa upp felveckade RNA som annars kan aktivera immunsystemet. Dubbelsträngat RNA finns normalt inte i kroppen och aktiverar immunsystemet via receptorn TLR3 vilket tolkas som ett virusangrepp och sätter igång ett försvarsprogram som kännetecknas av typ I interferon-signalering.

Separata kliniska associationer för de båda autoantikropparna finns rapporterat, t.ex. SLE med anti-Ro52 har oftare cytopenier, SLE med anti-Ro60 har oftare komplementkonsumtion. Sannolikt finns mer att lära sig om vilken prognostisk information de två autoantikropparna var för sig kan bidra med.

Litteratur

Decker P, et al. An updated review of anti-Ro52 (TRIM21) antibodies impact in connective tissue diseases clinical management. Autoimmun Rev. 2022 Mar;21(3):103013. doi: 10.1016/j.autrev.2021.103013

Shiboski CH, et al. International Sjögren’s Syndrome Criteria Working Group. 2016 American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism Classification Criteria for Primary Sjögren’s Syndrome: A Consensus and Data-Driven Methodology Involving Three International Patient Cohorts. Arthritis Rheumatol. 2017 Jan;69(1):35-45. doi: 10.1002/art.39859

Lee AYS, et al. Anti-Ro60 and anti-Ro52/TRIM21: Two distinct autoantibodies in systemic autoimmune diseases. J Autoimmun. 2021 Nov;124:102724. doi: 10.1016/j.jaut.2021.102724

Choi MY, Costenbader KH. Understanding the Concept of Pre-Clinical Autoimmunity: Prediction and Prevention of Systemic Lupus Erythematosus: Identifying Risk Factors and Developing Strategies Against Disease Development. Front Immunol. 2022 Jun 3;13:890522. doi: 10.3389/fimmu.2022.890522

De Carolis S, et al. Autoimmune Congenital Heart Block: A Review of Biomarkers and Management of Pregnancy. Front Pediatr. 2020 Dec 22;8:607515. doi: 10.3389/fped.2020.607515

Hedlund M, et al. Type I IFN system activation in newborns exposed to Ro/SSA and La/SSB autoantibodies in utero. RMD Open. 2020 Jan;6(1):e000989. doi: 10.1136/rmdopen-2019-000989

Kategorier
analyser SSB-ak (La)

SSB-ak (La)

Autoantikroppar mot SSB (kallas också La) ingick tidigare, tillsammans med anti-SSA, i klassifikationskriterierna för Sjögrens syndrom (SS) men togs bort i den senaste uppdateringen från 2016.

Utan tvekan är dock dubbelpositivitet (SSA och SSB) kopplat till sämre prognos vid SS. I en internationell registerstudie som sammanställde sjukdomsaktivitet i förhållande till närvaro av anti-SSA och/eller anti-SSB observerades att sjukdomsaktiviteten hos SS-patienter som vid diagnos enbart hade anti-SSB ligger nära de med enbart SSA och till och med något närmare dubbelpositiva än de med enbart anti-SSA. Dubbelnegativa SS-patienter hade som väntat lägst sjukdomsaktivitet.

Litteratur

Acar-Denizli N, et al. Sjögren Big Data Consortium. Systemic phenotype related to primary Sjögren’s syndrome in 279 patients carrying isolated anti-La/SSB antibodies. Clin Exp Rheumatol. 2020 Jul-Aug;38 Suppl 126(4):85-94.

Kategorier
analyser celiaki-serologi

Transglutaminas-ak, Deamiderat gliadin-ak

Den viktigaste blodprovsanalysen för att ställa diagnosen celiaki (glutenintolerans) är antikroppar av IgA-typ mot vävnadstransglutaminas (tTG). Dessa bildas lokalt i tarmen och kan detekteras där innan de kommer ut i blodet. De nu föråldrade testerna för antikroppar mot retikulin eller endomysium som tidigare användes för att diagnostisera celiaki har senare visat sig binda till just tTG.

Gluten är en del av vete vars viktigaste proteiner utgörs av gliadin och glutenin. I råg och korn finns proteiner som är så lika de i gluten att immunsystemet inte ser skillnaden.

Den del av gliadin som lättast ger upphov till en immunreaktion (den immunodominanta peptiden) presenteras effektivt för T-hjälparceller av antigen-presenterande celler under förutsättning att de på cellytan bär de antigen-presenterande molekylerna HLA-DQ2 eller HLA-DQ8, vilket 30-40% i västvärlden gör. Dock är det bara cirka 1% som får celiaki.

Enzymet tTG förändrar gluten, mer specifikt avlägsnar det amidgrupper från aminosyran glutamin som då blir glutamat. Detta resulterar i deamiderat gliadin, vilket gör det ännu lättare för HLA-molekylerna att presentera gliadin-peptiderna för T-celler.

De aktiverade gluten-specifika T-cellerna är framförallt av T hjälpar (th)1-fenotyp, vilket bland annat innebär att de producerar mycket gamma-interferon. De hjälper sedan B-celler som har fått en B-cellsreceptor med specificitet för gliadin eller tTG-gliadin-komplex att aktiveras och bli antikroppsproducerande plasmaceller. Gluten/gliadin är centralt, då inga tTG-specifika T-celler har identifierats, däremot kommer tTG-specifika B-celler att aktiveras och bilda tTG-antikroppar.

Enligt den rådande hypotesen aktiveras en T-cell vars T-cellsreceptor är specifik för komplexet tTG-gliadin presenterat på HLA-DQ2 eller HLA-DQ8. En B-cell som är specifik för tTG tar upp ett gliadin-tTG komplex, processar det, och presenterar en passande peptid för dessa T-celler som i och med detta kan hjälpa B-cellen att bli plasmaceller som producerar IgA eller IgG mot tTG. Trots att det kroppsegna enzymet tTG alltid finns kvar så krävs gluten/gliadin (som kommer med kosten) som bärarmolekyl för att aktivera immunsystemet. Därför försvinner immunreaktivitet, vävnadsskada, och antikroppar efter några månader (minst 12) med glutenfri kost. Men plasmaceller specifika för tTG finns kvar i lamina propria efter flera år av glutenfri kost men de verkar inte utöva någon patogen effekt. Det är sannolikt intraepiteliala cytotoxiska T-celler som utövar den direkta skadan på tarmepitelet i celiaki och antikropparna är bara en markör för immunaktivering.

Förutom att deamidera gluten och göra det mer immunogent så är tTG även ett autoantigen vid celiaki. Normalt finns enzymet intracellulärt men vid inflammation och vävnadsskada frisätts det extracellulärt. Repetitiva glutamin-prolin-rika sekvenser i gliadin bidrar till att de inte spjälkas effektivt i mag-tarmkanalen. De tas upp i tunntarmens lamina propria vilket är lagret i tarmväggen där flest immunceller finns. Möjligen krävs en initial barriärskada i tarmväggen både för att gliadin ska tas tas få tillträde till lamina propria men också för att tTG ska exponeras extracellulärt för immunsystemet.

Transglutaminas (egentligen transglutaminas 2) ingår i en familj av enzymer och autoantikroppar mot vissa av de andra medlemmarna har intressanta kliniska kopplingar. anti-tTG3 är kopplats till dermatitis herpetiformis och anti-tTG6 är kopplat till gluten-ataxi, två extraintestinala manifestationer av celiaki i huden respektive hjärnan.

antikroppar mot tTG av IgA typ är den känsligaste markören för celiaki men de första åren i livet är totalkoncentrationen av IgA låg och chanserna att identifiera alla sjuka (sensitiviteten) för detta test är då lägre. För personer med IgA-brist (som dessutom har 10-20 gånger ökad risk att utveckla celiaki) är detta test inte användbart. I dessa fall används anti-tTG-IgG istället. Även anti-deamiderat gliadin IgG är ett alternativ med högre sensitivitet hos unga barn.

Litteratur

Maglio M, Troncone R. Intestinal Anti-tissue Transglutaminase2 Autoantibodies: Pathogenic and Clinical Implications for Celiac Disease. Front Nutr. 2020 May 29;7:73. doi: 10.3389/fnut.2020.00073.

Wolf J, et al., Validation of Antibody-Based Strategies for Diagnosis of Pediatric Celiac Disease Without Biopsy. Gastroenterology. 2017 Aug;153(2):410-419.e17. doi: 10.1053/j.gastro.2017.04.023.

Kategorier
ANA analyser

ANA

Kärnantikroppar (ANA), d.v.s. autoantikroppar som binder in till komponenter i cellkärnan har varit centralt vid diagnostik av autoimmuna sjukdomar sedan 50-talet. Traditionellt påvisas ANA med celler odlade på objektsglas och bedöms visuellt i mikroskop. Med tiden har man lärt sig att olika specificiteter (målmolekyler i cellen som ger olika mönster i mikroskopet) är kopplade till olika sjukdomar. ANA analyseras i första hand vid misstänka om systemisk lupus erytematosus (SLE), Sjögrens syndrom, systemisk skleros, polymyosit, mixed connective tissue disease (MCTD), eller autoimmun hepatit.

För ANA används vanligen celler som kallas HEp-2 som är en cellinje framtagen från människa. HEp-2 har stor cellkärna och hög delningshastighet vilket ger goda chanser att se celler i olika delar av cellcykeln i samma synfält vid avläsning i mikroskop. Patientserum tillsätts och eventuella autoantikroppar får chans att binda in till antigen i cellerna. Efter tvätt tillsätts grönt fluorescerande detektionsantikroppar riktad mot alla antikroppar av IgG-typ som finns på objektsglaset. Vid positivt resultat analyseras provet igen med flera olika spädningar och den högsta spädningen (mest utspädda provet) som fortfarande ger positivt resultat anges som en titer i svaret från laboratoriet. Denna metod kallas indirekt immunofluorescens (IIF) och anses fortfarande vara guldstandard även om bra antigenspecifika metoder har utvecklats på senare tid.

Kliniska immunologilaboratorier ska ha flera metoder uppsatta för ANA för att täcka upp för metodspecifika svagheter och dessutom ha möjlighet att bekräfta positiva fynd. ALBIA (t.ex. Luminex) är en bra metod för ANA-specificiteter såsom dubbelsträngat DNA och specifika proteiner i cellkärnan, för vilka termen extractable nuclear antigens (ENA) används. Alternativt kan ANA-specificiteter analyseras med utvalda antigen bundna till cellulosamembran, vilket kallas lineblot.

Huruvida fynd av autoantikroppar mot sjukdomskopplade antigen utanför cellkärnan rapporteras som positiv ANA varierar men en medelväg är att i dessa fall svara ut ANA som negativ men kommentera bifyndet att cytoplasmatisk reaktivitet ses och vilken sjukdom detta mönster i första hand skulle kunna vara förenligt med. Detta medför att termen ANA strikt sett är något föråldrad. Det har föreslagits att en mer korrekt term ska ersätta ANA, exempelvis anti-cellular antibodies som redan är etablerat på ett fåtal ställen i världen.

Dessa är de vanliga mönster som alla klassificeras som positiv ANA med angivet mönster och titer i svaret från laboratoriet: Homogen, Kornig, Nukleolär, Centromer, Kärnmembran, Nuclear dots, Proliferating cell nuclear antigen (PCNA).

Homogen ANA
Kornig ANA
Nukleolär ANA
Centromer-ANA
Nuclear dots-ANA. Bilder: Hannes Lindahl

ANA ska enligt den överenskomna definitionen vara positiv hos knappt 5% av friska blodgivare. Detta innebär att alla laboratorier måste justera sitt protokoll för analys av ANA så att gränsen för positivitet uppfyller detta kriterium. Detta görs främst genom att välja en lämplig grundspädning med vilken inte för många (eller för få) friska blodgivare klassificeras positiva avseende ANA.

Hos äldre och sjukhusvårdade förväntas andelen vara högre. Detta innebär att det positiva prediktiva värdet av positiv ANA i en oselekterad grupp människor är lågt och pre-test probability måste vara tydligt förhöjd för att testet ska vara meningsfullt. Vissa ANA-mönster och ANA-specificiteter kan ha något högre specificitet dock. Men det ändrar inte faktumet att ANA inte är lämplig som ett screening-verktyg på stora delar av befolkningen.

Litteratur

ANA Patterns

Agmon-Levin N, et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 2014 Jan;73(1):17-23. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-203863

Sharp GC, et al. Mixed connective tissue disease–an apparently distinct rheumatic disease syndrome associated with a specific antibody to an extractable nuclear antigen (ENA). Am J Med. 1972 Feb;52(2):148-59. doi: 10.1016/0002-9343(72)90064-2

Bossuyt X, et al. Understanding and interpreting antinuclear antibody tests in systemic rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2020 Dec;16(12):715-726. doi: 10.1038/s41584-020-00522-w

Kategorier
analyser centromer-ak

Centromer-ak

Autoantikroppar mot centromerer är en av de tre viktigaste immunologiska markörerna för systemisk skleros (SSc), tillsammans med antikroppar mot Scl-70/anti-topoisomeras I och anti-RNA polymeras III. Centromer-ak är associerat till begränsad kutan SSc (de övriga två med diffus kutan SSc). Centromerantikroppar är också kopplade till ökad risk för pulmonell arteriell hypertension (PAH) men minskad risk för interstitiell lungsjukdom.

Centromer-ak detekteras ibland hos patienter med primär biliär kolangit (PBC), Sjögren’s syndrom, eller SLE och i alla de fallen ser man ofta milda inslag av systemisk skleros i sjukdomsbilden.

I klassifikationskriterierna för SSc anges anti-centromer-antikroppar utan närmare specifikation. Vid indirekt immunofluorescens (IIF), d.v.s. det vanliga testet för ANA, ger centromer-ak ett mycket karaktäristisk utseende. Klassiskt bekräftas specificiteten med en immunoassay som inkluderar rekombinant centromerprotein B (CENP-B) men sedan några år tillbaka finns även tester med CENP-A vilka har rapporterats ha högre specificitet för SSc, men dessa är fortfarande inte i lika utbrett bruk. Vanligast är dock att dessa centromerantikroppar visar reaktivitet för båda antigenen men ibland detekteras enbart reaktivitet mot CENP-A. I sällsynta fall ses reaktivitet mot CENP-C, men kommersiella tester för detta antigen är inte tillgängliga.

Autoantikroppar mot CENP-F ger inte ett klassiskt centromermönster vid IIF utan ger ett mönster som helt enkelt kallas CENP-F-likt och det är inte kopplat till systemisk skleros eller någon annan specifik sjukdom. Det har rapporterats att åtminstone hälften av patienter med detta mönster har en samtidig cancer. Antigenspecifikt test för CENP-F är inte kommersiellt tillgängligt.

Litteratur

Cavazzana I, et al. Systemic Sclerosis-Specific Antibodies: Novel and Classical Biomarkers. Clin Rev Allergy Immunol. 2022 Jun 18. doi: 10.1007/s12016-022-08946-w

van den Hoogen F, et al. 2013 classification criteria for systemic sclerosis: an American college of rheumatology/European league against rheumatism collaborative initiative. Ann Rheum Dis. 2013 Nov;72(11):1747-55. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-204424

Mahler M, et al. Clinical and serological evaluation of a novel CENP-A peptide based ELISA. Arthritis Res Ther. 2010;12(3):R99. doi: 10.1186/ar3029

Kategorier
analyser Scl-70-ak

Scl-70-ak

Anti-Scl-70 kallas också anti-topoisomeras I och är en av de tre autoantikroppar som ingår i aktuella klassifikationskriterier för systemisk skleros (SSc).

Scl-70-ak är framför allt kopplat till undergruppen diffus kutan SSc samt ökad risk för interstitiell lungsjukdom (ILD) och död. Vid positivt resultat hos patient som inte uppfyller klassifikationskriterier för SSc är det bra att känna till att det inte är helt ovanligt med falskt positiva resultat med kommersiella tester.

Scl-70-ak har studerats och använts i över 40 år men en begränsning är att metodiken har ändrats under dessa år vilket kan påverka generaliserbarheten av tidigare rapporterade associationer. Immunodiffusion är den mest specifika metoden men används inte lika mycket längre till förmån för ELISA, ALBIA, och lineblot. Av dessa är ELISA minst specifik. Studierna som visade association mellan anti-Scl-70 och ILD detekterade autoantikroppen med den mer specifika metoden immunodiffusion och det är inte säkert att kopplingen är kliniskt användbar när moderna men mindre specifika metoder används.

Litteratur

Jandali B, et al. The Effect of Anti-Scl-70 Antibody Determination Method on Its Predictive Significance for Interstitial Lung Disease Progression in Systemic Sclerosis. ACR Open Rheumatol. 2022 Apr;4(4):345-351. doi: 10.1002/acr2.11398

Lam BH, et al. False positive anti-Topoisomerase I (Scl-70) antibody results in clinical practice: A case series from a scleroderma referral center. Semin Arthritis Rheum. 2022 Oct;56:152052. doi: 10.1016/j.semarthrit.2022.152052

Douvas AS, et al. Identification of a nuclear protein (Scl-70) as a unique target of human antinuclear antibodies in scleroderma. J Biol Chem. 1979 Oct 25;254(20):10514-22